蛋白層析柱一般用于純化蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是各種大分子物質(zhì)之間理化特性的差異性。親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時(shí)應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。

 

　　生物大分子和配體之間達(dá)到平衡的速度很慢，所以樣品液的濃度不易過高，上樣時(shí)流速應(yīng)比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時(shí)間進(jìn)行吸附。當(dāng)配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質(zhì)較多時(shí)，可以在上樣后停止流動(dòng)，讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時(shí)間，或者將上樣后流出液進(jìn)行二次上樣，以增加吸附量。

 

　　樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強(qiáng)的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強(qiáng)度，以減小基質(zhì)、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。

 

　　層析柱的柱效測(cè)定是在純化實(shí)驗(yàn)中非常重要的步驟，也是我們得到準(zhǔn)確結(jié)果的保證。如果您是自己裝柱，建議您在使用前先做柱效測(cè)定來確定柱子的效果。另外，當(dāng)層析柱使用過一定次數(shù)，或者發(fā)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常，柱子進(jìn)入氣泡，超壓等問題，我們也可以對(duì)柱子進(jìn)行柱效測(cè)定來判斷柱效是否正常。

 

　　蛋白層析柱的柱效測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)：

 

　　柱效測(cè)定主要通過計(jì)算理論踏板高度（HETP）和對(duì)稱性（As）來確定，Pulsetest是目前常用的測(cè)試方法，即使用少量的樣品流經(jīng)裝填好的層析柱中，通過儀器上的檢測(cè)器檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)洗脫峰進(jìn)行分析。